NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) es un método de amplificación de fragmentos de material genético. Fue desarrollado por J. Compton en 1991, quien lo definió como "una tecnología dependiente de primers que puede ser usada para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una mezcla única a una sola temperatura".
Inmediatamente después de la invención de NASBA, se usó para el diagnóstico rápido y cuantificación de VIH-1 en el plasma de pacientes.
NASBA es una técnica que permite la amplificación exponencial de una determinada muestra de ARN o ADN, aunque está especialmente diseñada para la amplificación de ARN.
Esta técnica es más rápida que el PCR y no necesita equipamiento (termociclador), ya que todo el proceso tiene lugar a 41ºC (proceso isotérmico).
El NASBA requiere una serie de componentes principales para que se inicie la reacción:
1. Muestra de ARN (o ADN) que se desea amplificar.
2. Enzimas que catalizan la reacción:
3. Cebadores.
El NASBA se divide en dos fases principales: la primera fase está compuesta por seis pasos únicos y secuenciales mientras que la segunda fase presenta otros seis pasos asincrónicos y cíclicos. Durante todo el proceso la muestra se mantiene a una temperatura constante de 41ºC. Las etapas del NASBA son las siguientes:
Con este paso finaliza la primera fase del NASBA, en la que a partir de una molécula de ARN diana (+) se genera una mezcla de ARN diana (-) y cDNA bicatenario con un promotor T7.
Esta segunda fase es cíclica por lo que la secuencia se copia millones de veces y se consigue una amplificación muy eficiente. Además en cada ciclo la secuencia diana no se copia en dos como sucede en la PCR sino que se copia tanta veces como la T7P pueda (alrededor de 1000).
Para amplificar ADN obtenido, se añade un paso de desnaturalización para hacer que la sonda b- hibride y hacer que la retrotranscriptasa comience a polimerizar el ADN.
El producto amplificado mediante NASBA se puede cuantificar por diferentes métodos:
El NASBA es una técnica que permite una amplificación exponencial de ARN a partir de una muestra inicial dada. El factor de amplificación está entre 500 y 1000 veces. La cantidad de moléculas generadas depende del número de moléculas iniciales.
Esta técnica presenta una serie de ventajas:
-Es un proceso isotérmico, es decir, no se requiere termociclador, así el proceso se simplifica y es mucho más barato.
-Está diseñado específicamente para la detección de virus de ARN y otros microorganismos difíciles de detectar (Chlamydias) al detectar los ARNm. Para amplificar dianas de ADN es preciso desnaturalizarlo para que la RT una el cebador b con el promotor de la T7P.
El NASBA presenta una serie de limitaciones, pues su sensibilidad y especificidad no son muy elevadas, generándose falsos positivos y falsos negativos.
El método NASBA fue desarrollado por J Compton en 1991, quien la definió como 'una tecnología dependiente de los primer que puede ser usada para la continua aplicación de los ácidos nucleicos en una mezcla a una temperatura.'.
Al principió se usó para diagnosticar y cuantificar a los pacientes de HIV-1.
El ARN puede ser amplificado a través de PCR usando una transcriptas inversa. Pero, la principal venta del NASBA es que funciona en condiciones isotermales, normalmente a una temperatura constante de 41ºC.
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