Carga viral es la cuantificación de la infección por virus que se calcula por estimación de la cantidad de partículas virales en los fluidos corporales, como por ejemplo ARN viral por mililitros de sangre.
La carga viral se usa para control terapéutico de virosis crónicas y control de pacientes inmunosuprimidos como los que han recibido trasplante (medicina) de órganos o de células madre hematopoýeticas o de médula ósea.
Las mediciones de carga viral más frecuentes en la actualidad son para casos de infección por VIH, citomegalovirus y de hepatitis viral C y B.
En el diagnóstico y tratamiento del VIH la carga viral es la cuantificación de VIH-1 que se encuentra en el plasma o cuantificación del RNA vírico que existe en una muestra. El método empleado consiste en técnicas de biología molecular o de diagnóstico genético, usando la reacción en cadena de la polimerasa.
La carga viral resulta un marcador de la actividad del VIH-1 y junto con la determinación de CD4 miden la competencia del sistema inmune de la persona.
La determinación de la carga viral plasmática (CV) del VIH es el marcador de respuesta al tratamiento antirretroviral más sensible, rápido y fiable. La CV se correlaciona directamente con el pronóstico clínico, el riesgo de transmisión viral y el recuento de CD4. Es una herramienta básica en el manejo clínico de la persona seropositiva ya que permite:
- Detectar el fracaso terapéutico con rapidez.
- Ayudar a modificar el plan terapéutico antes de que se desarrollen complicaciones clínicas.
- Sospechar interacciones medicamentosas, alteraciones farmacocinéticas o una adhesión terapéutica insuficiente.
La inhibición de la replicación viral mediante el tratamiento antirretroviral retrasa la progresión de la enfermedad, prolonga la esperanza de vida, mejora la calidad de vida y disminuye los efectos adversos de la medicación.
Junto con genotipificación viral, la detección cuantitativa de RNA está indicada en los casos de hepatitis por VHB y VHC que serán sometidos a terapia antiviral con el fin de evaluar el pronóstico y respuesta virológica.
Para el pronóstico se considera que a mayor carga viral basal, menor probabilidad de una respuesta sostenida.
La respuesta al tratamiento antiviral se evalúa con una carga viral basal (pre-tratamiento) y al menos una carga viral al término de este y a las 24 semanas post tratamiento. Se considera una buena respuesta al tratamiento antiviral si se obtiene una carga viral indetectable al término del tratamiento y una carga viral indetectable y/o RNA cualitativo negativo a las 24 semanas (respuesta viral sostenida). Igualmente se ha determinado que una carga viral temprana (respuesta viral precoz), con caída de 2 log 10 o más a las 4 o 12 semanas intra-tratamiento, permite evaluar precozmente la probabilidad de obtener una respuesta virológica sostenida al término de la terapia.
En caso del VHB la carga viral permitirá además, detectar la infección con mutantes pre-core (hasta 40% en zonas de alta endemia) donde existe ausencia de antígeno e (HBeAg) y por el aumento significativo de la carga viral detectar la aparición de mutantes resistentes a los medicamentos antivirales.
Los métodos más utilizados para la carga viral de VHB y VHC son aquellos que utilizan la amplificación del RNA (PCR competitiva; PCR en tiempo real) o la amplificación de señales (DNA ramificado, bDNA) pero presentan limitaciones importantes pues tienen diferentes rangos de detección y aún no poseen un denominador común de medición, por lo tanto no son equivalentes ni comparables. Por tal razón los números absolutos expresados en ellos son referenciales y la evaluación de una caída significativa de una carga viral debe ser evaluada siempre en función de la diferencia en logs en base 10.
La cuantificación viral del citomegalovirus (CMV) se recomienda para control y tratamiento de pacientes inmunodeficientes, como quienes padecen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o quienes reciben medicamentos inmunosupresores como parte de su tratamiento con trasplante (medicina)s y en los cuales el citomegalovirus puede producir serias complicaciones, como una afección oportunista, que ocasiona mayores tasas de morbilidad y mortalidad. La carga viral se requiere para monitorización de la profilaxis y del tratamiento preventivo o curativo con medicamentos antivirales que se recomienda en los casos de trasplante, dado que el CMV es el agente patógeno más importante que afecta los casos de trasplante por su correlación directa con el rechazo del injerto u órgano trasplantado. Se recomienda su realización semanal, al menos mientras el paciente permanezca ingresado.
Igualmente la carga viral existente en líquido amniótico es un factor predictivo de la transmisión intrauterina, y los niños con infección congénita sintomática excretan más virus en la orina que los que tienen una infección asintomática, aunque todavía no se ha podido relacionar la carga viral con el pronóstico en niños infectados de las complicaciones y secuelas de la infección por CMV como la hipoacusia neurosensorial.
Las técnicas usadas para determinar la carga viral de CMV son las técnicas de la PCR cuantitativa o PCR en tiempo real y las de inmunoensayo.
Existen diferentes técnicas para poder cuantificar la carga viral. Entre todas ellas podemos destacar las siguientes: PCR, NASBA, Amplificación Qβ y Amplificación en rama.
Todos estos sistemas (a excepción de la Amplificación Qβ) se encuentran actualmente en el mercado. Aunque presentan una buena correlación entre sí, es recomendable utilizar el mismo método para determinar la carga viral a lo largo de la terapia de un paciente, pues puede haber variaciones en los resultados.
Además, es muy importante tener en cuenta la existencia de diferentes cepas de un mismo microorganismo. Esto implica que un sistema puede ser más sensible a una cepa que otro y, por tanto, más recomendable.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se basa en la amplificación de la diana de manera exponencial mediante replicación. La sonda empleada y la señal no son amplificadas (algo que sí ocurre en alguna de las técnicas descritas más abajo en este mismo documento). Se requiere además de equipamiento: un termociclador que permita el cambio secuencial de temperaturas (95 °C, 72 °C, 47 °C) característico del proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa (conocido como PCR).
Se comienza con una población de pacientes que han resultado ser seropositivos tras la prueba diagnóstica ELISA. A continuación procedemos a realizar una PCR a todos estos individuos, de modo que se obtiene un recuadro parecido al ELISA, solo que en este caso la probabilidad de error es menor:
A partir de allí, esta técnica presentará los mismos parámetros que el resto de pruebas diagnósticas, a saber:
Se=VP/(FN+VP)
Sp=VN/(FP+VN)
Ambos parámetros correlacionan, de modo que un incremento de la sensibilidad de una prueba promueve una disminución de la especificidad de la misma, y viceversa.
Por otro lado, la PCR también presenta una serie de parámetros propios, tales como:
Una técnica de PCR poco fiel puede dar lugar a la presencia de muchos falsos negativos.
De entre los distintos tipos de PCR existentes, los usados para determinar la carga viral son:
Su denominación se corresponde con las siglas del nombre de esta técnica en inglés: Nucleic Acid Sequence Based Amplification. El proceso se basa en una amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. Dicha amplificación comienza por seis pasos únicos (1ª fase) a partir de los cuales se forma un bucle de otros seis pasos consecutivos que serán los que realmente amplifiquen la secuencia diana (2ª fase).Con este método se obtiene una amplificación de nuevo de la diana, pero en esta ocasión mediante transcripción (y no por replicación como ocurre en PCR). Al igual que en PCR, se consigue una amplificación exponencial, sin embargo en esta ocasión es mucho más rápida que en la PCR (ya que PCR amplifica sólo de dos en dos y esta mucho más). Cuenta además con la ventaja de no necesitar un termociclador, pues el proceso es isotérmico y se lleva a cabo en un baño a una determinada temperatura. La técnica ha sido diseñada especialmente para la detección de virus de ARN, aunque también nos sirve para otros microorganismos difíciles de detectar como las Chlamidias mediante la amplificación de los ARNm. Adicionalmente puede ser empleada para la detección de ADN.
Para la realización de NASBA la muestra susceptible de poseer ARN vírico se incuba junto con una mezcla de tres enzimas (retrotranscriptasa, ARNasaH o II y T7 ARN polimerasa) y dos cebadores (a+ complementario al extremo 5' y b- complementario al extremo 3', b- además se encuentra unido a una secuencia promotora T7).
El tubo que contiene todos estos componentes se ha de introducir en el baño que se encuentra a la temperatura idónea para la hibricación de los cebadores y la actuación de las enzimas.
1ª fase
2ª fase
Estos seis últimos pasos constituyen un bucle. Este ciclo se repetirá ya de forma continua hasta que detengamos el proceso (inactivando las enzimas por desnaturalización, sacando el tubo del baño isotérmico...).
El objetivo buscado es detectar la cantidad inicial de virus, es decir, la carga viral. Con NASBA podemos seguir dos procedimientos de cuantificación:
Electroquimioluminiscencia (ECL): se emplea el producto final del proceso NASBA para cuantificar. Para ello junto a la muestra de partida sobre la que realizamos NASBA, se añaden tres calibradores internos cuya secuencia es idéntica a la diana objeto de nuestro estudio salvo en 20 pares de bases que serán específicos de cada uno de ellos. Estos calibradores se encontrarán a unas concentraciones conocidas previamente: baja, media y alta respectivamente. Tras los sucesivos pasos de amplificación, y una vez terminado el proceso, la máquina que ha realizado el NASBA automáticamente dividirá la muestra en cuatro fracciones: diana, calibrador a baja concentración, calibrador a concentración media y calibrador a elevada concentración. Cada una de estas fracciones amplificadas hibridará con una sonda complementaria a los 20 pares de bases diferentes de cada amplicón. Dichas sondas contienen adheridas esferas magnéticos con estreptavidina. Las esferas se encuentran unidas a un electrodo, y a esta mezcla se añade otras sondas inespecíficas con ruterio, que también hibridarán con la secuencia amplificada. Una descarga eléctrica disparará la reacción de electroquimioluminiscencia, desprendiéndose una luz proporcional al número de copias iniciales de la secuencia diana. Comparando el resultado de la secuencia diana con los tres controles cuya concentración nos era conocida seremos capaces de obtener la carga viral inicial.
Balizas moleculares u oligobalizas: este método permitirá cuantificar a tiempo real. A la mezcla inicial de reacción se han de añadir unas sondas específicas denominadas balizas moleculares (Molecular beacon en inglés). Se tratan de unas secuencias con extremos complementarios entre sí de unos 5 pares de bases, pero que no son complementarios a la secuencia diana. Unido a uno de los extremos presentan un fluorocromo, mientras que en el extremo opuesto hay una molécula que inhibe al fluorocromo cuando está próximo a este.La zona situada entre estos dos extremos será la complementaria a la diana. Las oligobalizas cumplen estas mismas características, pero además funcionan como oligos para la amplificación.
Por tanto, cuando no exista secuencia diana con la que puedan hibridar, los extremos complementarios hibridarán entre sí y el fluorocromo estará inactivo. Pero cada vez que NASBA pase por el paso 6º o 12º las balizas moleculares se unirán a las secuencias complementarias del ARN diana amplificadas, separándose sus extremos y quedando liberado el fluorocromo, que emitirá una fluorescencia proporcional al número de hebras de ARN. Esto posibilita la cuantificando de la carga viral en cada uno de los ciclos.
El éxito de esta técnica frente a la PCR tradicional radica en que tras cada ciclo la secuencia diana no se copia en dos, sino en unas 1000 gracias a la T7 ARN polimerasa. Sin embargo, NASBA también presenta limitaciones: pueden aparecer fácilmente falsos negativos y falsos positivos, haciendo que no sea tan sensible y específica como lo sería la PCR en Transcriptasa inversa (RT-PCR). Esto tiene como consecuencia que, aunque sea adecuada para cuantificar, NASBA no debe ser empleada para confirmar o desmentir la presencia de ARNm de un determinado virus, ya que no es demasiado fiable. Para esto último sería recomendable emplear RT-PCR en su lugar.
Mediante esta técnica se amplifica la sonda específica que se une a la secuencia de interés (en este caso, del genoma viral), en lugar de amplificar tal secuencia, como ocurre en otros métodos. Para lograr la amplificación de la sonda, se utiliza la enzima Qβ replicasa, que es una polimerasa de ARN dependiente de ARN del bacteriófago Qβ que reconoce una estructura terciaria de ARN metaestable. Mediante este método se puede amplificar tanto ARN como ADN (este último debe ser previamente desnaturalizado para que sea ADN de cadena simple).
Se emplean dos tipos de sonda:
La sonda señalizadora y la de captura hibridan con el ácido nucleico diana (sobre cada molécula de genoma viral van a hibridar estas dos sondas). La captura de este complejo que se ha formado (sonda de captura-diana-sonda señalizadora) se consigue utilizando una secuencia poliC (complementaria por lo tanto a la secuencia de captura poliG) que posee una bola magnética en un extremo, de modo que al introducir un imán, queda retenido el complejo y se puede lavar y eliminar el exceso de sonda señalizadora no unida a la secuencia diana. Se suelen hacer una serie de nuevas hibridaciones con sonda captura y lavados, con el objetivo de eliminar sonda señalizadora sin unir y tener así solamente secuencia metaestable unida a la diana. Finalmente, se utiliza la enzima Qβ replicasa para amplificar la sonda señalizadora. Esta replicación es muy eficiente, generándose 106-109 copias por sonda señalizadora original en menos de 15 minutos. No se precisa el empleo de un termociclador, lo cual es una ventaja añadida.
La cuantificación y detección se realiza por colorimetría o por fluorescencia en tiempo real.
Es fundamental que la muestra quede perfectamente lavada. De no ser así, pueden aparecer falsos positivos, lo que supone una disminución de la especificidad de la técnica. Sin embargo, la sensibilidad suele ser elevada, pues es difícil la aparición de falsos negativos debido a la gran eficiencia de esta enzima.
Con esta técnica lo que se va a amplificar es la señal, no amplificándose ni viéndose alterado el número de secuencia diana ni de sondas, algo que sí ocurría en casos anteriores. La amplificación es lineal, al contrario de lo que ocurría en las técnicas anteriores donde era exponencial. Presenta la ventaja de no necesitar termociclador, pero la desventaja de no ser muy sensible. Sin embargo, sí que resulta muy útil para detectar distintas cepas de un mismo organismo gracias al empleo de las diferentes sondas descritas a continuación.
Para este proceso se van a emplear tres tipos de sondas diferentes:
El proceso ocurre en varios pasos:
Se pueden distinguir dos generaciones de este método de amplificación de ácidos nucleicos:
Esta técnica permite la detección de menos de 100 copias de ARN de VIH por ml de sangre, incluso sin preamplificación.
Dentro de este tipo de métodos podemos encontrar tres subtipos:
Además de las técnicas ya citadas, existen otros métodos utilizados para la cuantificación viral, tales como:
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